La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es una técnica de laboratorio que amplifica segmentos cortos de secuencias de ácido desoxirribonucleico ( ADN ) o ácido ribonucleico ( ARN ) mediante la enzima ADN polimerasa I, aislada de Thermus aquaticus, conocida como Taq ADN. [1][2] En 1985, Mullis y sus colegas introdujeron la PCR, por la que recibieron el Premio Nobel. [3] Es una herramienta fundamental en las ciencias biomoleculares por su capacidad para examinar y detectar componentes amplificados de ADN. [2]
La PCR es un procedimiento que se centra selectivamente en un segmento minúsculo de ADN en un tubo de ensayo. [1][4] La termoestabilidad tiene la propensión a resistir alteraciones irreversibles en las propiedades químicas y físicas a temperaturas extremas. [1] Después de varios ciclos repetitivos de desnaturalización y renaturalización en los procedimientos de PCR, se prefiere la enzima ADN polimerasa Taq debido a su propiedad termoestable, lo que permite la continuación de la síntesis de ADN a pesar de la exposición a los cebadores. [1][2] La PCR ha sido el procedimiento de elección prominente en el diagnóstico de una amplia gama de infecciones bacterianas y virales, así como en la detección de enfermedades genéticas debido a su alta sensibilidad, lo que la convierte en el procedimiento de prueba estándar de oro para numerosas muestras. [3]
¿Qué se necesita para una PCR?
Para realizar una PCR se necesita:
- ADN o ARN : El material genético que se quiere amplificar.
- Cebadores : Secuencias cortas de ADN que se complementan con las secuencias objetivo en el ADN o ARN. Los cebadores se utilizan para iniciar la reacción de amplificación.
- ADN polimerasa : Una enzima que cataliza la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
- Desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) : Los bloques de construcción del ADN.
- Tampón de reacción : Una solución que proporciona el entorno químico adecuado para la reacción de amplificación.
- Tubo de ensayo : Un recipiente donde se lleva a cabo la reacción.
- Termociclador : Un dispositivo que controla la temperatura durante la reacción de amplificación.
Procedimiento de la prueba PCR
Los procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa comienzan con la recolección de una pequeña muestra de ADN en un tubo de ensayo. [4] La PCR consta de tres fases principales: desnaturalización, hibridación/anexión y elongación/amplificación. [1]
- Desnaturalización : El ADN se calienta a 95 grados Celsius (C) para disociar los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases complementarias del ADN de doble cadena. [1]
- Hibridación/Anexión : Se enfría el ADN desnaturalizado a una temperatura que oscila entre 37-72 C, lo que permite que los enlaces de hidrógeno se vuelvan a formar. [4] La anexión se produce mejor a temperaturas entre 55 C y 72 C. [1] La temperatura específica se determina en función de las propiedades físicas y químicas de los cebadores específicos utilizados en la solución. [3] Los cebadores tienen una longitud de 20 a 25 nucleótidos. [5] La anexión permite que los cebadores se unan al ADN monocatenario en sus respectivos sitios complementarios, comenzando por el extremo 3’ de la plantilla de ADN. [1][3] Posteriormente, la unión de los cebadores a sus sitios complementarios en el ADN monocatenario genera dos moléculas de doble cadena.
- Elongación/Amplificación : Se selecciona una temperatura de reacción óptima de 75-80 C, que es la más adecuada para la replicación inducida por enzimas de ADN, para garantizar la actividad de la ADN polimerasa. [3] Para iniciar la funcionalidad de la ADN polimerasa, el ADN de doble cadena es obligatorio para que se produzca la replicación. [3] A partir de entonces, la ADN polimerasa sintetiza ADN en una dirección de 3’ a 5’, produciendo cadenas idénticas a las cadenas de la plantilla. [3] Este procedimiento se repite varias veces mediante un termociclador. [5] Un termociclador es un dispositivo que controla el tiempo y la temperatura de cada ciclo y sus respectivos pasos. [5] Esto lleva finalmente a varias copias de ADN duplicadas disponibles en el tubo. [1] Después de 30-40 ciclos, los ciclos repetitivos finalmente disminuyen debido a la capacidad limitada del reactivo, así como a otros factores contribuyentes, como la acumulación de moléculas de pirofosfato, la anexión excesiva y la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra. [3]
Inhibidores de la PCR
Hay varios inhibidores que pueden afectar al correcto funcionamiento de la PCR. Los inhibidores más comunes de la PCR son la proteinasa K, el fenol y el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). [5] La proteinasa K tiene la propensión a descomponer la ADN polimerasa Taq. [5] Otras sustancias que pueden afectar negativamente a las pruebas de PCR son los detergentes iónicos, la heparina, la espermidina y la hemoglobina. [5] Además, los colorantes de bromofenol y el azul de xileno pueden constituir complicaciones en las pruebas de PCR. [5]
Para superar estos problemas, las plantillas de ADN se pueden limpiar mediante diálisis y precipitación por etanol. Varias otras estrategias para limpiar la plantilla de ADN incluyen el uso de cloroformo con fines de extracción y la cromatografía. [5]
Tipos de prueba PCR
Existen diferentes tipos de pruebas PCR, entre los cuales se encuentran:
- PCR convencional : Es la técnica de amplificación de ADN más común. En esta técnica, se amplifican los fragmentos de ADN y luego se detectan mediante electroforesis en gel de agarosa.
- PCR en tiempo real (qPCR) : Esta técnica permite detectar y cuantificar el ADN amplificado en tiempo real, utilizando fluoróforos que se unen al ADN amplificado. Esta técnica es más rápida y sensible que la PCR convencional.
- PCR de transcripción inversa (RT-PCR) : Esta técnica se utiliza para amplificar el ARN, primero se transcribe a ADN complementario (ADNc) y luego se amplifica por PCR. Es una técnica muy útil para estudiar la expresión génica.
Ventajas de la PCR
La PCR es un método de amplificación de ADN ampliamente utilizado en diferentes campos de la ciencia, gracias a sus numerosas ventajas. Algunas de ellas son:
- Alta sensibilidad : La PCR es un método muy sensible que puede detectar pequeñas cantidades de ADN o ARN.
- Alta especificidad : La PCR es un método muy específico que puede detectar solo el ADN o ARN objetivo, sin amplificar otros fragmentos de ADN.
- Velocidad : La PCR es una técnica rápida que permite obtener resultados en unas pocas horas.
- Versatilidad : La PCR se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, como la detección de enfermedades, el análisis forense, la investigación genética, etc.
- Bajo costo : La PCR es una técnica relativamente barata que puede ser utilizada en muchos laboratorios.
Desventajas de la PCR
La PCR también presenta algunas desventajas, entre las que se encuentran:
- Sensibilidad a la contaminación : La PCR es un método muy sensible a la contaminación, por lo que es importante utilizar una técnica aséptica para evitar resultados falsos positivos.
- Limitaciones de la PCR convencional : La PCR convencional no puede cuantificar el ADN amplificado.
- Posibles errores : La PCR puede producir resultados falsos positivos o falsos negativos si no se realiza correctamente.
Interpretación de los resultados de la PCR
Los resultados de la PCR se interpretan en función del tipo de prueba que se realice. En la PCR convencional, los resultados se observan mediante electroforesis en gel de agarosa. Se busca la presencia de una banda de ADN correspondiente al tamaño del fragmento amplificado. En la qPCR, los resultados se observan en tiempo real y se cuantifican mediante el uso de un software específico.
Interpretación de los resultados de la PCR convencional
La PCR convencional se utiliza para detectar la presencia o ausencia de un gen o fragmento de ADN específico en una muestra. Los resultados se observan en un gel de agarosa, donde se busca la presencia de una banda de ADN correspondiente al tamaño del fragmento amplificado. Si la banda está presente, significa que el gen o fragmento de ADN específico está presente en la muestra. Si la banda no está presente, significa que el gen o fragmento de ADN específico no está presente en la muestra.
Interpretación de los resultados de la qPCR
La qPCR se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN o ARN en una muestra. Los resultados se muestran en una gráfica, donde el eje y representa la cantidad de fluorescencia y el eje x representa el número de ciclos. El punto de cruce (Ct) es el punto en el que la fluorescencia se eleva por encima del ruido de fondo. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ADN o ARN en la muestra. Una Ct baja indica una alta cantidad de ADN o ARN, mientras que una Ct alta indica una baja cantidad de ADN o ARN.
Importancia clínica de la PCR
La PCR es una herramienta fundamental en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas. Algunas de sus aplicaciones clínicas más importantes son:
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas : La PCR se puede utilizar para detectar la presencia de bacterias, virus, parásitos y hongos en muestras de sangre, orina, tejido y otros fluidos corporales.
- Diagnóstico de enfermedades genéticas : La PCR se puede utilizar para detectar mutaciones genéticas asociadas a enfermedades genéticas.
- Monitoreo de la terapia : La PCR se puede utilizar para monitorizar la efectividad de los tratamientos para enfermedades infecciosas y genéticas.
- Análisis forense : La PCR se puede utilizar para identificar a personas a partir de muestras de ADN.
- Investigación : La PCR es una herramienta fundamental en la investigación científica, especialmente en el campo de la genética, la biología molecular y la medicina.
Control de calidad y seguridad en el laboratorio
La PCR es una técnica muy sensible a la contaminación, por lo que es fundamental utilizar una técnica aséptica para evitar resultados falsos positivos. Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación cruzada de las muestras. Algunas recomendaciones de control de calidad y seguridad en el laboratorio son:
- Utilizar una técnica aséptica : Es fundamental utilizar una técnica aséptica para evitar la contaminación de las muestras. Esto significa que se deben utilizar guantes, batas y mascarillas, y que se deben limpiar las superficies de trabajo y el equipo con regularidad.
- Separar las áreas de trabajo : Se deben separar las áreas de trabajo para la preparación de las muestras, la realización de la PCR y el análisis de los resultados. Esto ayuda a minimizar el riesgo de contaminación cruzada.
- Utilizar reactivos de alta calidad : Es fundamental utilizar reactivos de alta calidad para asegurar la precisión de los resultados de la PCR . Los reactivos deben estar libres de contaminación.
- Utilizar equipo adecuado : Se debe utilizar el equipo adecuado para la PCR , como termocicladores, pipetas y tubos de ensayo. El equipo debe estar en buen estado de funcionamiento y debe ser calibrado regularmente.
- Realizar controles positivos y negativos : Se deben realizar controles positivos y negativos para verificar la precisión de la PCR . Los controles positivos deben dar un resultado positivo, mientras que los controles negativos deben dar un resultado negativo.
- Documentar los resultados : Es importante documentar todos los pasos de la PCR , incluyendo los resultados, las fechas y las personas que realizaron la prueba. La documentación ayuda a rastrear cualquier error o contaminación que pueda ocurrir.
Conclusión
La PCR es una técnica de amplificación de ADN de gran importancia en el campo de la biomedicina. Esta técnica permite detectar y cuantificar pequeñas cantidades de ADN o ARN, lo que la convierte en una herramienta fundamental para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas, la investigación científica y el análisis forense. Es importante seguir las recomendaciones de control de calidad y seguridad en el laboratorio para asegurar la precisión de los resultados de la PCR y evitar la contaminación.
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